Ambrósio Fregolente nasceu em São Paulo, mas saiu de lá rumo o Rio de Janeiro com a intenção de estudar medicina, projeto que logo foi interrompido, para começar a carreira de ator aos 33 anos.
Fez diversos filmes nas décadas de 50, 60 e 70, dos mais diferentes gêneros, como O Homem do Sputnik, Cala a Boca, Etelvina, Cidade Ameaçada, Assalto ao Trem Pagador, Bonitinha, Mas Ordinária, Crônica da Cidade Amada, O Beijo, O Mundo Alegre de Helô, O Homem Que Comprou o Mundo, A Penúltima Donzela e Os Paqueras, Sedução, O Ibrahim do Subúrbio, O Casamento, Anchieta, José do Brasil e Gargalhada Final.
Ao longo de sua vida, participou de mais de cem filmes e peças de teatro até falecer, aos 66 anos, enquanto participava das filmagens de Amante Latino, de Pedro Carlos Rovai.
Foi um dos atores que mais personificaram personagens de Nelson Rodrigues no cinema e no teatro.